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TriZol Pal（代氯仿试剂）货号：R1200
存储条件：0-30℃避光保存
TriZol Pal（代氯仿试剂）产品说明:
Trizol PAL 可与 Trizol Reagent（货号：R1000）配合使用，可代替氯仿，对裂解体系进行反复抽提以去除蛋白质，用途广泛，可从动物组织、植物材料、各种微生物及培养细胞等样品中提取总 RNA。样品在 Trizol 中被充分裂解的同时能够z大限度地保证 RNA 的完整性。在加入 Trizol PAL 离心后，溶液会分成三层：上层无色水相、中间层和下层红色有机相，RNA 分布在上清层中。收集上清层后，经异丙醇沉淀便可以回收得到总 RNA。提取的总 RNA 完整性好，无蛋白和 DNA污染，可用于各种分子生物学常规实验，如 RT-PCR、Real-time RT-PCR、Northern Blot、Dot Blot、体外翻译等。
自备试剂
Trizol Reagent（货号：R1000）、异丙醇、75%乙醇、无 RNase 的水（新开封或提取 RNA 专用）
注意事项:
1、预防 RNase 污染，应注意以下几方面：
1）使用无 RNase 的塑料制品和枪头，避免交叉污染。
2）玻璃器皿应在使用前于 180℃高温下干烤 4h，塑料器皿可在 0.5 M NaOH 中浸泡 10 分钟，用水chedi冲洗后高压灭菌。
3）配制溶液应使用无 RNase 的水。
4）操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。
2、提取的样品避免反复冻融，否则影响 RNA 提取得率和质量。
3、本使用本制品时应穿戴防护物品，如手套、眼罩、面罩等。如果不小心接触到眼睛，应立即用大量的水冲洗并前往医院治疗。使用时远离火种、热源。
3、保存在 75%乙醇中的 RNA 沉淀，2-8℃可以保存一周，-20℃条件下可以保存 1 年。
4、RNA 半衰期比较短，容易降解，建议提取后尽快进行后续实验，如反转录成 cDNA， Northern Blot 等。
5、若下游实验对 DNA 非常敏感，建议用不含 RNase 的 DNase I 对 RNA 进行处理。
操作步骤:
1、各种材料的处理.
1.1 植物组织：取新鲜植物组织在液氮中充分研磨或将植物组zhi剪碎后直接在 Trizol 中迅速研磨，每 30-50 mg 组织加入 1mL Trizol，混匀。
注：样品体积一般不要超过 Trizol 体积的 10%。
1.2 动物组织：取新鲜或-70℃冻存的动物组织尽量剪碎，每 30-50 mg 组织加入 1 mL Trizol，匀浆仪进行匀浆处理。或在液氮中研磨后加入 Trizol 1 mL 混匀。
注：样品体积一般不要超过 Trizol 体积的 10%。
1.3 单层培养细胞：吸去培养液，可直接在培养板中加入适量 Trizol（每 10 cm2 面积需要 1 mL Trizol），用取样器反复吹打使细胞裂解。也可用胰蛋bai酶处理后，将细胞溶液转移至 RNase-Free 的离心管中，300×g 离心 5 min，收集细胞沉淀，仔细吸除所有上清，加入 Trizol 1 mL 混匀。
注：1）收集细胞数量不要超过 1×10 7。
2）TRNzol 加量根据培养板面积决定，不是由细胞数决定。如果 Trizol 加量不足，可能导致提取的 RNA 中有 DNA 污染。
3）收集细胞时一定要将细胞培养液去除干净，否则会导致裂解不wan全，造成 RNA 的产量降低。
1.4 细胞悬液：离心收集细胞。每 5×10 6-1×10 7动物、植物和酵母细胞或每 10 7细菌细胞加入 1 mL Trizol。
注：1）加入 Trizol 前不要洗涤细胞，以免 RNA 降解。
2）一些酵母和细菌细胞可能需要匀浆仪或液氮研磨处理。
1.5 血液处理：直接取新鲜的血液，加入 3 倍体积 Trizol（推荐 0.25 mL 全血加入 0.75 mL Trizol），充分振荡混匀。
1.6 可选步骤：对于蛋白、脂肪、多糖或胞外物质含量高的样品，如肌肉组织、脂肪组织或植物的块茎，可以在匀浆处理后4℃，12,000 rpm（~13,400×g）离心 10 分钟以除去不溶物质，此时沉淀中含胞外物质、多糖和高分子量的 DNA，而 RNA存在于上清中。
2、样品中加入 Trizol 后反复吹打几次，使样本充分裂解。室温放置 5 分钟，使蛋白核酸复合物完quan分离。
3、向以上溶液中加入 Trizol Pal，每使用 1 mL Trizol 加入 0.2 mL Trizol Pal，盖好管盖，剧烈振荡 15 秒，室温放置 2-3分钟。
4、4℃ 12,000 rpm 离心 15 分钟，此时样品分成三层：红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA 主要在水相中，把水相（约 600μL）转移到一个新的 RNase-Free 离心管（自备）中。
5、在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温放置 10 分钟。
6、4℃ 12,000 rpm 离心 10 分钟，弃上清。
7、加入 75%乙醇（用无 RNase 的水配制）洗涤沉淀。每使用 1 mL Trizol 用 1 mL 75%乙醇对沉淀进行洗涤。
8、4℃ 12,000 rpm 离心 3 分钟，小心吸弃上清，注意不要吸弃 RNA 沉淀。
注：剩余的少量液体可短暂离心，然后用枪头吸出，注意不要吸弃沉淀。
9、室温放置 2-3 分钟，晾干。加入 30-100μL 无 RNase 的水，充分溶解 RNA，得到的 RNA 保存在-70℃，防止降解。
注：沉淀不要过分干燥，以免难于溶解
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